میکروسکوپ یکی از وسایل آزمایشگاهی اصلی در آزمایشگاه گیاه شناسی است. که در اینجا انواع آن را مورد بحث و بررسی قرار داده و طرز کار با میکروسکوپ نوری معمولی را به تفصیل ارائه مینمائیم.
میکروسکوپ های مختلف دارای بزرگنمائی های متفاوتی می باشند که عموماً با وجود عدسی های گوناگون، تصویر نمونه مورد نظر چند برابر می شود. اصول کلی در تمامی انواع میکروسکوپ ها براساس عبور نور با طول موج های متفاوت از چندین عدسی محدب می باشد که هرچقدر طول موج نور بکار رفته در میکروسکوپ مزبور کوتاهتر باشد قدرت تفکیک و یا جداکنندگی آن میکروسکوپ بیشتر است. برای مثال قدرت تفکیک چشم انسان ۱.۰ میلیمتر می باشد و میکروسکوپ نوری معمولی ۰.۲۴ میکرون.

تاریخچه
در سال ۱۶۵۵، رابرت هوگ که یک فیزیکدان انگلیسی بود، اولین نگرش میکروسکوپی را انجام داد. هوک که ۲۹ سال سن داشت به کمک اولین میکروسکوپ خود توانست بقایای دیواره سلول های مرده گیاهی را در برشی از چوب پنبه پوست درخت بلوط مشاهده کند. وی از آنچه دیده بود نقاشی هایی را رسم کرد و به علت شباهت اتاقک های کوچکی که در بافت چوب پنبه با لانه زنبور دیده بود، نام این اتاقک ها را سلول گذاشت. اما هوک در آن زمان نمی دانست که درون این اطاقک ها، ماده زنده ای که امروزه آن را پرتوپلاسم می نامیم وجود داشته است. هوک علاوه بر مشاهده چوب پنبه، اجزاء دیگری از موجودات مثل بال حشرات و چشم مرکب زنبور را هم بررسی کرده بود و نتیجه مشاهدات خود را در کتابی به نام «ذره نگاری» به چاب رساند.
اما حدود ۲۰ سال بعد و در سال ۱۶۷۴ آنتونی وان لیوون هوک. که یک پارچه فروش هلندی بود، برای اولین بار توانست به کمک میکروسکوپ دست ساز خود، تک سلول های زنده (آغازیان جانور مانند یا پروتوزوآها) را ببیند. در سال ۱۶۸۳ هوک با تکمیل میکروسکوپی که ساخته بود، توانست دنیای باکتری ها را نیز کشف کند. ساختار میکروسکوپ ها به آهستگی دستخوش دگرگونی هایی قرار گرفت و قدرت تفکیک آنها بهتر شد. اما ذات انسان از محدودیت بیزار است. میکروسکوپ های معمولی قدرت بزرگنمایی تا حدود ۱۵۰۰ برابر دارند. اما اگر می توانستیم دنیای ریزتر از این را هم ببینیم چقدر بهتر بود. این رویا در سال ۱۹۳۲ با ساخت اولین میکروسکوپ الکترونی به واقعیت پیوست.

سیر تحولی و رشد
در طول قرن هیجدهم میکروسکوپ در زمره وسایل تفریحی به شمار می آمد. با پژوهش های بیشتر پیشرفت های قابل توجهی در شیوه ساختن عدسی شیء حاصل شد. بطوری که عدسی های دیگر بصورت ذره بین های معمولی نبودند بلکه خطاهای موجود در آن ها که به کج نمایی معروف هستند، دفع شده اند و آن ها می توانستند جرئیات یک شیء را دقیق تر نشان دهند. پس از آن در طی پنجاه سال، پژوهشگران بسیاری تلاش کردند تا بر کیفیت و مرغوبیت این وسیله بیافزایند. بالاخره «ارنست آبه» توانست مبنای علمی میزان بزرگنمایی میکروسکوپ را تعریف کند.
بدین ترتیب میزان بزرگنمایی مفید آن بین ۵۰ تا ۲۰۰۰ برابر مشخص شد. البته می توان میکروسکوپ هایی با بزرگنمایی بیش از ۲۰۰۰ برابر ساخت. مثلا قدرت عدسی چشمی را بیشتر کرد. اما قدرت تفکیک نور ثابت است و درنتیجه حتی بزرگنمایی بیشتر می تواند دو نقطه از یک شی را بهتر تفکیک کند. هر چه بزرگنمایی شی افزایش یابد به میزان پیچیدگی آن افزوده می شود. بزرگنمایی شیء در میکروسکوپ های تحقیقاتی جدید معمولاً ۳x، ۶x، ۱۰x، ۱۲x، ۴۰x و ۱۰۰x است. در نتیجه بزرگنمایی در این میکروسکوپ بین ۱۸ تا ۱۵۰۰ برابر است. چون بزرگنمایی میکروسکوپ نوری بدلیل وجود محدودیت پراش از محدوده معینی تجاوز نمی کند برای بررسی بسیاری از پدیده هایی که احتیاج به بزرگنمایی خیلی بیشتر دارند مفید است. تحقیقات بسیاری صورت گرفت تا وسیله دقیق تری با بزرگنمایی بیشتر ساخته شود. نتیجه این پژوهش ها منجر به ساختن میکروسکوپ الکترونی شد.

میکروسکوپ نوری (Light Microscope)
منبع نور در این میکروسکوپ نور مرئی می باشد و با عبور از چندین عدسی محدب که در آن تعبیه شده است و نیز یک منشور که مسیر نور را تغییر میدهد (قدرت تفکیک ۲۴.۰ میکرون).

میکروسکوپ ماوراء بنفش (Ultra Violet Microscope)
میکروسکوپ ماوراء بنفش، یا میکروسکوپ U.V که منبع تغذیه نور، اشعه U.V می باشد. نسبت به میکروسکوپ نوری معمولی قدرت تفکیک بالاتری داشته چراکه اشعه ماوراء بنفش طول موج کوتاه تری نسبت به نور مرئی دارد. عدسی شیئی بکار رفته در این میکروسکوپ از جنس کوارتز می باشد. بدلیل مضر بودن اشعه ماوراء بنفش برای چشم انسان، از تصویر شیء عکس برداری شده و سپس بر روی صفحه مانیتور قابل مشاهده است (قدرت تفکیک ۶۰۰ آنگستروم).

میکروسکوپ فلورسنس (Fluorescence Microscope)
بطورکلی مواد از لحاظ خاصیت فلورسانس دو نوعند:
– فلورسانس اولیه که این مواد ذاتا خاصیت فلورسانس دارند یعنی از خود نور ساطع می کنند مثل ویتامین ها و رنگ ها.
– فلورسانس ثانویه که از خود خاصیت فلورسانسی نداشته و با رنگ آمیزی و معرف های گوناگون از قبیل سولفات بربرین و نارنجی آکریدین خاصیت فلورسانسی را به آن ها القاء می کنیم.
منبع تغذیه نور در این میکروسکوپ اشعه U.V می باشد.

میکروسکوپ زمینه سیاه (Dark Field Microscope)
منبع تغذیه نور در این نوع میکروسکوپ نور مرئی می باشد و با ایجاد انکسار نور توسط آیینه های محدب و مقعر شیء یا نمونه مورد بررسی، شفاف و نورانی در زمینه سیاه دیده می شود.

میکروسکوپ اختلاف فاز (Phase Contrast Microscope)
منبع تغذیه نور در این نوع میکروسکوپ نور مرئی می باشد و برای بررسی بافت ها یا نمونه هایی که اختلاف انکساری نوری کمی دارند مورد استفاده قرار می گیرد بدین منظور صفحه سوراخ داری به نام پلاک فاز در کندانسور تعبیه می شود.

میکروسکوپ الکترونی (Electron Microscope)
پیشرفته ترین میکروسکوپ قرن حاضر، با قدرت تفکیک ۲ آنگستروم است. در این میکروسکوپ با عبور پرتوهای الکترونی ساطع شده از رشته سیمی تنگستن با طول موج بسیار پائین از عدسی های متعدد که در نهایت بر روی یک صفحه فلورسنت یا صفحه مانیتور، عکسبرداری صورت گرفته و تصویر شیء قابل مشاهده می باشد.

مکانیزم
میکروسکوپ مرکب از یک لوله تشکیل شده که در دو انتهای آن دو عدسی شئی نزدیک به شی مورد مطالعه و عدسی چشمی قرار دارد. تصویری که توسط عدسی شئی بوجود می آید، بوسیله عدسی چشمی بزرگتر می شود. به این جهت بزرگنمایی آن بیش از قدرت یک عدسی است. در میکروسکوپ های پیشرفته، دستگاه نوری پیچیده تر است. بدین ترتیب که در آنها علاوه بر لامپ، یک کندانسور (مجموعه عدسی های متمرکز کننده نور) و یک دیافراگم که شدت نور را کنترل می کند، قرار داده شده است. لامپی که در این نوع میکروسکوپ ها مورد استفاده قرار می گیرد، با ولتاژ کم کار می کند. لامپ های فراوانی برای این منظور وجود دارند که هرکدام نوری با شدت و طول موج مورد نظر تامین می کنند. بنابراین برای تفکیک دو نقطه نزدیکتر از ۲۵۰۰ آنگستروم باید از میکروسکوپ الکترونی استفاده کرد.
زیرا طول موج الکترون از طول موج نور کمتر است. اولین میکروسکوپ الکترونی که ساخته شد، درست مانند میکروسکوپ نوری که شعاع نور را از داخل نمونه مورد مطالعه عبور می دهد، شعاع الکترون را از داخل مقطع بسیار نازکی عبور می دهد. چون تراکم مواد در تمام قسمت های نمونه مورد مطالعه یکسان نیست، میزان الکترونی که از قسمت های مختلف عبور می کند متفاوت است. درنتیجه تصویری از قسمت های تاریک و روشن آن بدست می آید. میکروسکوپ الکترونی دارای یک قسمت لوله ای شکل است که الکترون می تواند آزادانه از آن عبور کند. در قسمت بالای لوله یک قطب منفی الکتریکی به شکل رشته سیم نازک وجود دارد که جنس آن از تنگستن است. این قسمت آنقدر حرارت داده می شود تا بتواند از خود الکترون آزاد کند.
این عمل با ایجاد اختلاف پتانسیل از ۲۰۰۰۰ تا ۱۰۰۰۰۰ ولت بین کاتد و آند صورت می گیرد. در نتیجه یک شعاع الکترونی بسوی پایین قسمت لوله ای شکل شتاب داده می شود. به این سیستم تفنگ الکترونی می گویند. در طول لوله عدسی هایی همگرا اندازه و روشنایی شعاع الکترونی را قبل از برخورد با نمونه مورد مطالعه کنترل می کنند. مقطع مورد بررسی روی یک صفحه مشبک دایره شکلی قرار داده می شود. شعاع الکترونی پس از عبور از مقطع و قبل از این که به حد بزرگنمایی نهایی برسد، از میان عدسی هایی شئی عبور کرده و تنظیم می شود. سپس توسط عدسی هایی بر روی صفحه زیر میکروسکوپ منعکس می شود. چگالی بزرگنمایی بیشتر میکروسکوپ ها از ۵۰ تا ۸۰۰۰۰۰ برابر است. صفحه زیر میکروسکوپ از مواد فسفردار (فسفید روی) پوشانیده شده که در مقابل پرتو الکترون از خود نور تولید می کند. در زیر این صفحه یک دوربین عکاسی قرار دارد که از تصویر روی صحنه عکس می گیرد.

اطلاعاتی که میکروسکوپ الکترونی ارائه می دهد
توپوگرافی شیء (نقشه برداری): در این کار با آشکار کردن مشخصات سطح و بافت داخلی شی، می توان به خواصی مانند سفتی و میزان ارتجاعی بودن آن پی برد.
مورفولوژی (زیست شناسی): به دلیل اینکه در این رؤیت شکل و سایر ذرات مشخص است، می توان به نیروی استحکام پی برد.
ترکیب: این میکروسکوپ می تواند عناصر سازنده شی را مشخص نماید. بنابراین می توان به خواصی مانند نقطه ذوب، اکتیویته شی دست یافت.
بلور شناسی: میکروسکوپ الکترونی چگونگی چیده شدن اتم را در مجاورت یکدیگر نشان می دهد. به این ترتیب می توان آنها را از نظر رسانایی و خواص الکتریکی بررسی نمود.

اجزای میکروسکوپ نوری
اجزای نوری: اجزای نوری عمدتا مشتمل بر منبع تغذیه نور و قطعات مرتبط با آن می باشد، از قبیل لامپ با ولتاژ ۲۰ وات، فیلتر تصحیح نور و کندانسور که کندانسور مشمل بر پنج قطعه است که نور را تصحیح کرده و بر روی نمونه یا شیء مورد بررسی متمرکز می کند:
۱. فیلتر رنگی (تصحیح نور)
۲. دیافراگم که حجم نور را تنظیم می کند
۳. دو عدد عدسی محدب
۴. پیچ نگهدارنده کندانسور
۵. پیچ تنظیم دیافراگم
۶. اجزای مکانیکی:
– پایه (Base): کلیه قطعات میکروسکوپ بر روی پایه مستقر می باشد. در برخی از مدل های میکروسکوپ نوری منبع نور، فیوز و کابل برق در پایه تعبیه می گردد.
– دسته (Handle) : جهت حمل و نقل میکروسکوپ از دسته استفاده می شود. نکته قابل توجه آنکه به هنگام جابجایی میکروسکوپ آن را روی میز کار نمی کشیم.
– لوله میکروسکوپ (Barrel): مشتمل بر عدسی شیئی (Ocular lens) و عدسی چشمی (Objective lens) که با بزرگنمایی های مختلف طراحی می شوند. عدسی شیئی دارای بزرگنمائی های ۴x، ۱۰x، ۴۰x، ۶۰x و ۱۰۰x و عدسی چشمی دارای بزرگنمائی های ۱۰x، ۱۵x، ۱۸x می باشد که بسته به نوع میکروسکوپ متفاوت است. عدسی شیئی معمولا از چندین عدسی محدب که در آن تعبیه شده است تشکیل می گردد.
– صفحه گردان یا متحرک (Revolver): عدسی های شیئی بر روی این صفحه قرار می گیرند و با چرخاندن آن موقعیت عدسی های شیئی تغییر می کند.
– پیچ حرکات تند (Macrometrique): این پیچ بر روی دسته تعبیه شده است و باعث می گردد که صفحه پلاتین با سرعت بیشتری در جهت عمودی جابجا شود.
– پیچ حرکات کند (Micrometrique): این پیچ بر روی پیچ حرکات تند قرار داد و صفحه پلاتین را در جهت عمودی و درحد میکرون جابجا می کند.
– صفحه پلاتین (Platine plate): صفحه ای است که نمونه مورد نظر روی آن قرار می گیرد و در جهت طول و عرض دارای دو خط کش مدرج می باشد که جهت ثبت و یادداشت مکان یک نمونه خاص بکار می رود.
– پیچ طول و عرض: این پیچ زیر صفحه پلاتین قرار دارد که آن را در جهت طول و عرض جابجا می کند.
بزرگنمایی یک میکروسکوپ حاصل ضرب بزرگنمایی عدسی شیئی در بزرگنمایی عدسی چشمی می باشد.

پیشرفته ترین میکروسکوپ جهان
تیتان پیشرفته ترین میکروسکوپ الکترونی جهان را ساخت. این میکروسکوپ دارای ریز بینی تا حد ۰.۷ انگستروم می باشد. این میکروسکوپ توانسته است رکورد قبلی میکروسکوپ های با کاربرد تجاری که یک سال قبل توسط شرکت FEI ثبت شده بود را بشکند. این میکروسکوپ مجهز به تک رنگ نگار و تصحیح کننده انحراف می باشد.